Fils d'imprimeur, Henry Fonda fait des études à la Central High School d'Omaha puis à l'université du Minnesota où il se passionne pour le journalisme. De retour à Omaha, il rencontre Dorothy Brando, mère du célèbre Marlon, qui l'engage pour jouer au théâtre You and I de Philip Barry. En 1929, il débute à Broadway. Le succès qu'il remporte avec New faces of 1934 lui permet de jouer The farmer takes a wife, d'après Marc Connelly. La Fox en fait une adaptation cinématographique et lui confie de nouveau le rôle.
Henry Fonda appartient à la race des hommes qui font la légende de l'Ouest et de l'Amérique des solides valeurs morales : personnage idéaliste et absolu. C'est déjà le cas avec La fille du bois maudit (1935) d'Henry Hathaway, quand il paraît sous les traits exemplaires d'un montagnard isolé. Mais c'est J'ai le droit de vivre (1937) de Fritz Lang qui le révèle au côté de Sylvia Sydney en chômeur dressé contre le destin. Un drame sudiste, L'insoumise (1938) de William Wyler, qui préfigure Autant en emporte le vent, le met à l'épreuve avec Bette Davis. Mais son pas mesuré, son geste sobre et éloquent à la fois, son regard intense suffisent à en faire une figure remarquable. Auprès de stars masculines telles que Tyrone Power, il s'affirme grâce à la précision de sa composition (Le brigand bien-aimé, 1939, d'Henry King). Le rôle emblématique du jeune Abraham Lincoln (Vers sa destinée), pour lequel l'acteur porte un faux nez, inaugure une longue collaboration avec John Ford. On le voit prononçant les monologues de Tom Joad d'une voix nouée dans Les raisins de la colère (1940) de John Ford puis se prêtant à la comédie sophistiquée de Lady Eve (1941) de Preston Sturges. Cependant, la Fox lui impose trop de films secondaires à son goût. L'étrange accident (1943) de William A. Wellman, qui l'offre en pâture à des lyncheurs déchaînés, est selon lui l'unique bon film qu'il tourne en cinq ans. Mis à part The long night (1947) d'Anatole Litvak, remake du Jour se lève de Marcel Carné où il succède à Jean Gabin, La poursuite infernale (1946) et Le massacre de Fort Apache (1948) de John Ford, où on le retrouve en officier de cavalerie inflexible et glacial, s'inscrivent dans le même registre. Après une longue interruption due à la guerre et au théâtre, Henry Fonda reprend le rôle du lieutenant Roberts pour Mister Roberts (1955) de John Ford et Mervyn LeRoy, rôle refusé par William Holden. Il se brouille alors avec Ford. Mais les propositions affluent. Scrupuleux Pierre du Guerre et Paix (1956) de King Vidor, il est la même année le pathétique Faux coupable d'Alfred Hitchcock puis le juré dissident qui s'oppose aux préjugés de ses collègues dans Douze hommes en colère (1957) de Sydney Lumet. Mais son meilleur rôle est Leffingwell, l'ancien communiste que le président mourant s'efforce de faire nommer secrétaire d'Etat dans Tempête à Washington (1962) d'Otto Preminger. Héros du Jour le plus long (1962) d'Andrew Marton, Ken Annakin et Bernhard Wicki, il devient démoniaque pour Il était une fois dans l'ouest (1969) de Sergio Leone. Aux prises avec la peur de la mort dans La maison du lac (1981) de Mark Rydell qu'il tourne avec sa fille Jane, Henry Fonda décède l'année suivante.
D'août 1942 à octobre 1945, Henry Fonda sert la Marine américaine sur un destroyer. En 1947, il retourne sur les planches après onze ans d'absence pour interpréter à Philadelphie Mister Roberts mis en scène par Joshua Logan. Il joue également Point of no return de John P. Marquand, The Caine mutiny court martial, d'après le roman d'Herman Wouk, Deux sur la balançoire de William Gibson et Clarence Darrow, d'après le roman d'Irving Stone.
Pour la télévision, il tourne notamment Stranger on the run (1967) de Don Siegel.