Après avoir étudié au lycée Montaigne à Paris, il retourne en Géorgie. Il part ensuite à Moscou pour étudier le Droit, qu'il délaisse rapidement pour suivre les cours d'art dramatique de Stanislavsky. En 1920, après avoir été journaliste et créateur d'une troupe de théâtre, il fonde à Londres une compagnie de théâtre avec des comédiens russes. Quatre ans plus tard, Rouben Mamoulian gagne New York pour diriger le théâtre de George Eastman où il met en scène plusieurs pièces.
En 1929, la Paramount, qui recherche des metteurs en scène de théâtre pour réaliser des films parlants, fait appel à Rouben Mamoulian pour mettre en scène Applause, un film sonore ayant pour thème la vie d'une vedette de music-hall. Deux ans plus tard, il met en scène Gary Cooper et Sylvia Sidney dans un film de série noire, Les Carrefours de la ville (1931) puis, dans un tout autre genre, Dr Jekyll and Mr Hyde (1932) avec Frederic March et Miriam Hopkins. Rouben Mamoulian se caractérise alors par sa capacité à tourner des films très différents. Ainsi après un film de gangsters puis un film fantastique, il se tourne en 1931 vers la comédie musicale avec Love me tonight, mettant en scène Maurice Chevalier et Jeannette MacDonald. En 1933, c'est Marlene Dietrich qu'il met en scène dans Song of songs (Cantique d'amour), un film mélodramatique. La même année, il quitte la Paramount pour la MGM et fait tourner une autre grande star du cinéma, Greta Garbo, dans La Reine Christine. Après s'être attaqué aux films parlants, Rouben Mamoulian réalise en 1935 le premier grand film américain en couleurs, Becky Sharp, dont il a su accentuer l'atmosphère en utilisant la couleur. Le film reçoit le prix du meilleur film en couleurs au festival de Venise. Avec La Furie de l'or noir tourné en 1938, il s'attaque cette fois au western. Après un film sur la boxe, Golden boy en 1939, Rouben Mamoulian réalise en 1940 Le Signe de Zorro. En 1942, il tourne Qui perd gagne avec Henry Fonda et Gene Tierney, avant de s'éclipser durant dix ans des plateaux de cinéma. En 1957, il renoue avec la comédie musicale dans La Belle de Moscou, grosse production américaine réunissant Fred Astaire et Cyd Charisse. Ce film sera son dernier car tous les projets de réalisation suivants lui sont retirés par les producteurs hollywoodiens, qui lui reprochent de ne pas les mener à terme.
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Rouben Mamoulian est également connu comme metteur en scène de théâtre : Porgy (1928), Porgy and Bess (1935) et Oklahoma ! (1943).
Longs métrages 1929 | Applause | Rouben Mamoulian |
| 1931 | City Streets Les Carrefours de la ville | Rouben Mamoulian |
| 1931 | Love Me Tonight Aimez-moi ce soir | Rouben Mamoulian |
| 1932 | Dr Jekyll and Mr Hyde Docteur Jekyll et Mister Hyde | Rouben Mamoulian |
| 1933 | Queen Christina La Reine Christine | Rouben Mamoulian |
| 1933 | Song of Songs (The) Le Cantique des cantiques | Rouben Mamoulian |
| 1934 | We Live Again Terre de résurrection | Rouben Mamoulian |
| 1935 | Becky Sharp | Rouben Mamoulian |
| 1936 | Gay Desperado (The) Le Joyeux bandit | Rouben Mamoulian |
| 1937 | High, Wide and Handsome La Furie de l'or noir | Rouben Mamoulian |
| 1939 | Golden Boy L'Esclave aux mains d'or | Rouben Mamoulian |
| 1940 | Mark of Zorro (The) Le Signe de Zorro | Rouben Mamoulian |
| 1941 | Blood and Sand Arènes sanglantes | Rouben Mamoulian |
| 1941 | Rings on Her Fingers Qui perd gagne | Rouben Mamoulian |
| 1948 | Summer Holiday Belle jeunesse | Rouben Mamoulian |
| 1956 | Silk Stockings La Belle de Moscou | Rouben Mamoulian |
| 1958 | Porgy and Bess | Otto Preminger, Rouben Mamoulian |
| 1958 | Never Steal Anything Small | Charles Lederer |
| 1931 | Love Me Tonight Aimez-moi ce soir | Rouben Mamoulian |
| 1932 | Dr Jekyll and Mr Hyde Docteur Jekyll et Mister Hyde | Rouben Mamoulian |
| 1933 | Song of Songs (The) Le Cantique des cantiques | Rouben Mamoulian |
| 1931 | Love Me Tonight Aimez-moi ce soir | Rouben Mamoulian |
| 1984 | George Stevens : A Filmmaker's Journey | George Stevens Jr. |