Marie Gillain a toujours rêvé de devenir comédienne. A l'âge de treize ans, elle entre au Vivier, un atelier théâtral liégeois, et deux ans plus tard, elle part en tournée au Québec avec la troupe.
En 1991, Marie Gillain décide de passer une audition pour L'Amant de Jean-Jacques Annaud. Le réalisateur ne retient pas sa candidature, mais elle est remarquée par Gérard Lauzier qui l'engage pour incarner la fille de Gérard Depardieu dans Mon père, ce héros. Un premier rôle dès sa première apparition à l'écran, une reconnaissance immédiate. La fraîcheur et la spontanéité de son interprétation lui valent dès ce premier film une nomination pour le César du meilleur jeune espoir féminin. En 1994, Bertrand Tavernier l'engage pour incarner Nathalie dans L'Appât, inspiré d'un fait divers réel : sans repères, imprégnée d'images télévisées, Nathalie se laisse entraîner dans un engrenage meurtrier. Marie Gillain confirme son talent : son personnage est un savant mélange de perversité, d'innocence et d'inconscience. Elle obtient d'ailleurs le Prix Romy Schneider qui récompense les jeunes talents de l'année. Très en vue, elle monte les marches du Palais des festivals à Cannes pour présenter Les Affinités électives (1995) de Paolo et Vittorio Taviani, adapté d'une oeuvre de Goethe. Suit Le Bossu (1997) de Philippe de Broca, un film d'époque pour les besoins duquel elle prend des cours d'escrime. En 1999, Marie Gillain revient à Cannes pour défendre Harem suare (1998) de Ferzan Ozpetek : favorite d'un sultan, elle tombe amoureuse d'un eunuque. Ce personnage froid n'est pas dénué de sensualité, et le corps de l'actrice s'insère dans des plans composés d'après des tableaux du peintre Ingres. Elle enchaîne avec des films plus populaires comme Barnie et ses petites contrariétés (Bruno Chiche, 2000), ou encore Absolument fabuleux (id.), adaptation par Gabriel Aghion de la série à succès américaine.
Marie Gillain retrouve Bertrand Tavernier pour Laissez-passer en 2000, puis joue dans une petite comédie d'Isabelle Broué aux côtés de Julien Boisselier (Tout le plaisir est pour moi, 2003). Les tournages s'espacent un temps pour cause de grossesse, mais Marie Gillain revient sur le devant de la scène en 2006. Elle est à l'affiche notamment de Pars vite et reviens tard, l'adaptation attendue du polar de Fred Vargas mise en scène par Régis Wargnier.
La clef de Guillaume Nicloux sort sur les écrans fin 2007, en même temps que la comédie douce-amère Ma vie n'est pas une comédie romantique de Marc Gibaja. En 2008, elle incarne une des cinq résistantes des Femmes de l'ombre de Jean-Paul Salomé, dans lequel elle donne la réplique à Sophie Marceau et Julie Depardieu.
En 1993, Marie Gillain tourne pour la télévision Un homme à la mer de Jacques Doillon.
Au théâtre, elle joue dans Le Journal d'Anne Franck (1995).
A partir de 1996, l'actrice devient conteuse pour une série de concerts intitulés L'Orchestre à la portée des enfants, organisés par les Jeunesses musicales de Liège et de Bruxelles. Marie Gillain prête sa voix à des oeuvres telles que La Boîte à joujoux de Claude Debussy, L'Histoire de Babar de Francis Poulenc, Pierre et le Loup de Serge Prokofiev, Casse-Noisette de Piotr Ilitch Tchaïkovski.
En 1999, elle devient l'égérie du parfum Ô Oui de Lancôme.
Longs métrages 1991 | Mon père, ce héros | Gérard Lauzier |
| 1992 | Marie | Marian Handwerker |
| 1994 | Appât (L') | Bertrand Tavernier |
| 1995 | Affinità elettive (Le) Les Affinités électives | Vittorio Taviani, Paolo Taviani |
| 1996 | Un air si pur | Yves Angelo |
| 1997 | Bossu (Le) | Philippe de Broca |
| 1998 | Cena (La) Le Dîner | Ettore Scola |
| 1998 | Harem suare Le Dernier harem | Ferzan Özpetek |
| 1999 | Laissons Lucie faire ! | Emmanuel Mouret |
| 2000 | Absolument fabuleux | Gabriel Aghion |
| 2000 | Barnie et ses petites contrariétés | Bruno Chiche |
| 2000 | Laissez-passer | Bertrand Tavernier |
| 2001 | Ni pour, ni contre (bien au contraire) | Cédric Klapisch |
| 2003 | Tout le plaisir est pour moi | Isabelle Broué |
| 2004 | Enfer (L') | Danis Tanovic |
| 2005 | Kung Fu Panda | Mark Osborne, John Stevenson |
| 2006 | Clef (La) | Guillaume Nicloux |
| 2006 | Fragile (s) | Martin Valente |
| 2006 | Ma vie n'est pas une comédie romantique | Marc Gibaja |
| 2006 | Pars vite et reviens tard | Régis Wargnier |
| 2007 | Femmes de l'ombre (Les) | Jean-Paul Salomé |
| 2007 | Magique ! | Philippe Muyl |
| 2007 | Très très grande entreprise (La) | Pierre Jolivet |
| 2008 | Coco avant Chanel | Anne Fontaine |
| 2009 | Traversée du désir (La) | Arielle Dombasle |
| 2010 | Kung Fu Panda 2 | Jennifer Yuh-Nelson |
| 2010 | Toutes nos envies | Philippe Lioret |
| 2012 | Landes | François-Xavier Vives |
| 2013 | Mirage d'amour avec fanfare | Hubert Toint |
| 2014 | Valentin Valentin | Pascal Thomas |
| 2019 | Mystère | Denis Imbert |
| 2020 | Goliath | Frédéric Tellier |