Après son passage en classe d'art dramatique à l'Illinois State University, John Malkovich entre comme comédien à la compagnie de théâtre Steppenwolf et interprète les plus grands rôles du théâtre contemporain. Metteur en scène à plusieurs reprises, notamment pour The Caretaker (Harold Pinter) et No man's land (id.), il débute à l'écran en 1984 dans Les saisons du coeur (Robert Benton), où il joue le rôle d'un aveugle.
John Malkovich, acteur majeur du cinéma américain depuis les années 1990, est réputé pour son habileté à camper les personnages les plus variés. Optant pour des films intenses et dramatiques, il crée des personnages souvent insaisissables, extravagants ou vulnérables. Manipulateur redoutable de L'empire du soleil (Steven Spielberg, 1987), séducteur pervers des Liaisons dangereuses (Stephen Frears, 1988) ou géant simplet dans Des souris et des hommes (Gary Sinise, 1992), il se voit confier d'emblée les rôles les plus énigmatiques, mais toujours émouvants. Avec son impressionnante silhouette, il interprète avec conviction l'assassin psychopathe du film de Wolfgang Petersen, Dans la ligne de mire (1992).
D'autres grands réalisateurs font également appel à lui : tels Manoel De Oliveira pour Le couvent (1994), Luc Besson pour le rôle du roi Charles VII dans sa Jeanne d'Arc (1998), ou encore Spike Jonze, qui le consacre dans son propre rôle (Dans la peau de John Malkovich, 1998).
Francophile et homme cultivé, John Malkovitch tient à merveille le rôle du flegmatique et énigmatique Charlus dans Le Temps retrouvé de Raul Ruiz (1998), un cinéaste qu'il retrouve à deux autres reprises avec Les Ames fortes (2000) et Klimt (2005) où l'acteur interprète le peintre à la fin de sa vie. Malkovitch mélange les genres avec jubilation.
On le voit dans des purs divertissements américains comme le fantastique Eragon (Stefen Fangmeier, 2005) où il est le méchant Galbatorix, comme la comédie d'action Red (Robert Schwentke, 2009) où il fait partie d'un commando d'agents de la CIA à la retraite mais qui reprennent du service, ou comme le film de science-fiction Transformers 3 (2010) où Michael Bay lui confie un second rôle. Parallèlement à ces films d'entertainment, John Malkovtich s'essaye à des films plus risqués comme la comédie franco-britannique Appelez-moi Kubrick (Brian W. Cook, 2004) où il incarne un anonyme imposteur se faisant passer pour le grand réalisateur.
En 2007 il tourne successivement dans le drame de Clint Eastwood L'Echange (il interprète le révérend Gustav Briegleb, un pasteur médiatique qui viendra en aide à Angelina Jolie dans son combat pour retrouver son fils enlevé par un maniaque), et dans l'hilarante comédie des frères Coen Burn after reading où il campe l'inénarrable et alcoolique Osbourne Cox, un ex-analyste de la CIA. Dans Disgrace (Steve Jacobs, 2008) Malkovitch est un professeur d'université forcé de démissionner après avoir abusé d'une de ses élèves noires ; l'histoire se déroule en Afrique du Sud, et dépeint les rapports entre deux communautés après la fin de l'Apartheid, mais aussi les rapports inégaux qui subsistent entre les hommes et les femmes.
John Malkovich a joué dans une dizaine de téléfilms. Il est également producteur, metteur en scène et comédien au théâtre.
Courts métrages 2002 | Hideous Man | John Malkovich |
| 2002 | Hideous Man | John Malkovich |
| 2000 | Somewhere Else | Fanny Jean-Noël |
| 2000 | Steppenwolf Theatre Company : 25 Years on the Edge | Matt Hoffman |
| 2002 | Hideous Man | John Malkovich |
| 2006 | Call (The) | Antoine Fuqua |
| 2006 | Pilots | Tom Gerber |
| 2011 | Butterflies | Sandro Miller |
| 2012 | Educazione siberiana | Gabriele Salvatores |
| 2013 | Ecstasy | Sandro |
Longs métrages| 2001 | Pasos de baile Dancer upstairs | John Malkovich |
| 2001 | Ghost World | Terry Zwigoff |
| 2001 | Loner (The) | Gregori Viens |
| 2001 | Pasos de baile Dancer upstairs | John Malkovich |
| 2003 | Kill the Poor | Alan Taylor |
| 2004 | Libertine (The) Rochester, le dernier des libertins | Laurence Dunmore |
| 2006 | Art School Confidential | Terry Zwigoff |
| 2007 | Juno | Jason Reitman |
| 2010 | Young Adult | Jason Reitman |
| 2012 | Perks of Being a Wallflower (The) Le Monde de Charlie | Stephen Chbosky |
| 2002 | How to Draw a Bunny | John Walter |
| 2009 | Abel | Diego Luna |
| 2009 | Which Way Home | Rebecca Cammisa |
| 2013 | Cesar Chavez | Diego Luna |
| 1988 | Accidental Tourist (The) Voyageur malgré lui | Lawrence Kasdan |
| 2015 | Demolition Démolition | Jean-Marc Vallée |
| 1977 | A Wedding Un mariage | Robert Altman |
| 1983 | Killing Fields (The) La Déchirure | Roland Joffé |
| 1984 | Places in the Heart Les Saisons du coeur | Robert Benton |
| 1985 | Death of a Salesman La Mort d'un commis voyageur | Volker Schlöndorff |
| 1985 | Eleni | Peter Yates |
| 1987 | Empire of the Sun L'Empire du soleil | Steven Spielberg |
| 1987 | Glass Menagerie (The) La Ménagerie de verre | Paul Newman |
| 1987 | Making Mr Right Et la femme créa l'homme parfait | Susan Seidelman |
| 1988 | Dangerous Liaisons Les Liaisons dangereuses | Stephen Frears |
| 1988 | Miles from Home Rien à perdre | Gary Sinise |
| 1989 | Sheltering Sky (The) Un thé au Sahara | Bernardo Bertolucci |
| 1990 | Object of Beauty Les Imposteurs | Michael Lindsay-Hogg |
| 1991 | Jennifer Eight Jennifer 8 | Bruce Robinson |
| 1991 | Queens Logic Bienvenue au club | Steve Rash |
| 1991 | Shadows and Fog Ombres et brouillard | Woody Allen |
| 1992 | Alive Les Survivants | Frank Marshall |
| 1992 | In the Line of Fire Dans la ligne de mire | Wolfgang Petersen |
| 1992 | Of Mice and Men Des souris et des hommes | Gary Sinise |
| 1994 | Convento (O) Le Couvent | Manoel de Oliveira |
| 1994 | Mary Reilly | Stephen Frears |
| 1994 | Par delà les nuages | Michelangelo Antonioni, Wim Wenders |
| 1994 | Waterworld | Kevin Reynolds |
| 1995 | Mulholland Falls Les Hommes de l'ombre | Lee Tamahori |
| 1995 | Roi des Aulnes (Le) | Volker Schlöndorff |
| 1996 | Cannes Man | Richard Martini |
| 1996 | Con Air Les Ailes de l'enfer | Simon West |
| 1996 | Portrait of a Lady (The) Portrait de femme | Jane Campion |
| 1997 | Man in the Iron Mask (The) L'Homme au masque de fer | Randall Wallace |
| 1998 | Being John Malkovich Dans la peau de John Malkovich | Spike Jonze |
| 1998 | Jeanne d'Arc | Luc Besson |
| 1998 | Rounders Les Joueurs | John Dahl |
| 1998 | Temps retrouvé (Le) | Raoul Ruiz |
| 1999 | Knockaround Guys Les Hommes de main | Brian Koppelman, David Levien |
| 1999 | Ladies Room | Penelope Buitenhuis, Gabriella Cristiani |
| 1999 | RKO 281 Citizen Welles | Benjamin Ross |
| 1999 | Shadow of the Vampire L'Ombre du vampire | Elias Merhige |
| 2000 | Ames fortes (Les) | Raoul Ruiz |
| 2000 | Je rentre à la maison | Manoel de Oliveira |
| 2000 | Speak Truth to Power | Marc Levin |
| 2001 | Adaptation. | Spike Jonze |
| 2001 | Hotel | Mike Figgis |
| 2002 | Gioco di Ripley (Il) | Liliana Cavani |
| 2002 | Johnny English | Peter Howitt |
| 2002 | Um filme falado Un film parlé | Manoel de Oliveira |
| 2004 | Colour Me Kubrick Appelez-moi Kubrick | Brian W. Cook |
| 2004 | Hitchhiker's Guide to the Galaxy (The) H2G2 : Le guide du voyageur galactique | Garth Jennings |
| 2004 | Libertine (The) Rochester, le dernier des libertins | Laurence Dunmore |
| 2005 | Beowulf La Légende de Beowulf | Robert Zemeckis |
| 2005 | Eragon | Stefen Fangmeier |
| 2005 | Klimt | Raoul Ruiz |
| 2006 | Art School Confidential | Terry Zwigoff |
| 2006 | Great Buck Howard (The) Mister Showman | Sean McGinly |
| 2006 | Mutant Chronicles | Simon Hunter |
| 2007 | Burn After Reading | Joel Coen, Ethan Coen |
| 2007 | Changeling L'Echange | Clint Eastwood |
| 2007 | Gardens of the Night | Damian Harris |
| 2007 | In Tranzit | Tom Roberts |
| 2008 | Bloody Mondays and Strawberry Pies | Coco Schrijber |
| 2008 | Disgrace Disgrâce | Steve Jacobs |
| 2008 | Et après | Gilles Bourdos |
| 2009 | Jonah Hex | Jimmy Hayward |
| 2009 | Traversée du désir (La) | Arielle Dombasle |
| 2010 | Drunkboat | Bob Meyer |
| 2010 | Red | Robert Schwentke |
| 2010 | Saturday Night | James Franco |
| 2010 | Secretariat | Randall Wallace |
| 2010 | Transformers : Dark of the Moon Transformers 3 : La face cachée de la Lune | Michael Bay |
| 2011 | Lignes de Wellington (Les) | Valeria Sarmiento |
| 2012 | Noseland | Aleksey Igudesman |
| 2012 | Red 2 | Dean Parisot |
| 2012 | Side by Side | Chris Kenneally |
| 2012 | Warm Bodies Warm Bodies - Renaissance | Jonathan Levine |
| 2013 | Casanova variations | Michael Sturminger |
| 2013 | Cesar Chavez | Diego Luna |
| 2013 | Penguins of Madagascar Les Pingouins de Madagascar | Simon J. Smith, Eric Darnell |
| 2014 | Cut Bank | Matt Shakman |
| 2014 | Journey to Sundance | Julian Starks |
| 2014 | Paradoxe de John Malkovich (Le) | Pierre-François Limbosch |
| 2014 | Unlocked Conspiracy | Michael Apted |
| 2015 | Deepwater Horizon Deepwater | Peter Berg |
| 2015 | Zoolander 2 | Ben Stiller |
| 2017 | Mile 22 22 miles | Peter Berg |
| 2017 | Wilde Wedding (The) | Damian Harris |
| 2018 | Ava | Tate Taylor |
| 2018 | Bird Box | Susanne Bier |
| 2018 | Velvet Buzzsaw | Dan Gilroy |
| 2019 | Space Force [TV] | Paul King, Tom Marshall, Dee Rees |