Alors qu'il suit des études d'architecture à Princeton, James Stewart interprète quelques rôles dans la troupe de l'université. Il fait du théâtre sa vocation et se produit de 1928 à 1935 sur les scènes new-yorkaises. En 1935, il décroche un contrat de sept ans avec la Metro-Goldwyn-Mayer.
James Stewart s'impose rapidement à Hollywood et se produit dans huit films en 1936. Il trouve son premier grand rôle avec Seventh heaven (1937) d'Henry King, qui marque déjà les traits de caractère de son personnage : noblesse des sentiments, humour en demi-teinte, fantaisie lunaire. Avec Vous ne l'emporterez pas avec vous (1938) et Mr. Smith au Sénat (1939), Frank Capra le transforme en une sorte de symbole personnifiant la pureté, l'altruisme et la fidélité aux mythes fondateurs de l'Amérique. Intelligent, l'acteur sait faire preuve d'équilibre dans ses interprétations, dans la comédie comme dans le mélodrame. Après la Seconde Guerre mondiale, James Stewart gagne en maturité et trouve le point culminant de sa collaboration avec Frank Capra dans La Vie est belle (1947). Il s'affirme alors comme un justicier infatigable, épris de vérité et de justice, même au prix du doute ou du sacrifice. En 1947, il est le journaliste au grand c.ur de Appelez Nord 777 d'Henry Hathaway ou l'homme qui se bat contre la maladie dans Un homme change son destin de Sam Wood. Mais c'est dans le western que son humanisme s'exprime le mieux. Il devient un des grands interprètes du genre, comme le prouvent les films de Delmer Daves (La Flèche brisée, 1949) et surtout d'Anthony Mann. Avec ce dernier, il signe quelques grandes réussites, dont Winchester 73 (1950), qui font de lui un des acteurs favoris du public américain. Avec Alfred Hitchcock, qui l'emploie notamment pour La Corde (1948) et L'Homme qui en savait trop (1955), James Stewart gagne en subtilité et explore les ambiguïtés de son personnage. Otto Preminger récolte les fruits de ce travail et donne à l'acteur son rôle le plus complet dans Autopsie d'un meurtre (1959). Les années 1960 et 1970 ne provoquent pas beaucoup d'étincelles, même si elles sont marquées par une rencontre, peut-être trop tardive, avec John Ford (L'Homme qui tua Liberty Valance, 1962) et un dernier face-à-face émouvant avec John Wayne (Le Dernier des géants, 1975, de Don Siegel).
Grâce à ses actions durant la Seconde Guerre mondiale, James Stewart est promu général dans l'armée de l'air.
Dans les années 1970, il anime des émissions de télévision.
Courts métrages 1934 | Art Trouble | Ralph Staub |
| 1936 | Important News | Edwin Laurence |
| 1938 | Hollywood Goes to Town | Herman Hoffman |
| 1939 | Hollywood Hobbies | George Sidney |
| 1939 | Screen Snapshots Series 18 n° 8 : Stars at the Tropical Ice Gardens | Ralph Staub |
| 1942 | Fellow Americans | Garson Kanin |
| 1942 | Winning Your Wings | John Huston |
| 1943 | Screen Snapshots Series 23 n° 1 : Hollywood in Uniform | Ralph Staub |
| 1944 | Thunderbolt | William Wyler, John Sturges |
| 1948 | 10 000 Kids and a Cop | Charles Barton |
| 1950 | And Then Were Four | Frank R. Strayer |
| 1956 | Screen Snapshots : Hollywood, City of Stars | Ralph Staub |
| 1980 | Mr. Krueger's Christmas | Kieth Merrill |
Longs métrages| 1935 | Murder Man (The) | Tim Whelan |
| 1936 | After the Thin Man Nick, gentlemen détective | W.S. Van Dyke |
| 1936 | Born to Dance L'Amiral mène la danse | Roy Del Ruth |
| 1936 | Gorgeous Hussy (The) L'Enchanteresse | Clarence Brown |
| 1936 | Next Time We Love Epreuves | Edward H. Griffith |
| 1936 | Rose Marie | W.S. Van Dyke |
| 1936 | Small Town Girl | William A. Wellman |
| 1936 | Speed | Edwin L. Marin |
| 1936 | Wife vs. Secretary Sa femme et sa dactylo | Clarence Brown |
| 1937 | Navy Blue and Gold Les Cadets de la mer | Sam Wood |
| 1937 | Seventh Heaven L'Heure suprême | Henry King |
| 1937 | Vivacious Lady Mariage incognito | George Stevens |
| 1938 | Ice Follies of 1939 (The) La Féérie de la glace | Reinhold Schunzel |
| 1938 | Last Gangster (The) Le Dernier gangster | Edward Ludwig |
| 1938 | Of Human Hearts | Clarence Brown |
| 1938 | Shopworn Angel (The) L'Ange impur | Henry C. Potter |
| 1938 | You Can't Take It with You Vous ne l'emporterez pas avec vous | Frank Capra |
| 1939 | Destry Rides Again Femme ou démon | George Marshall |
| 1939 | It's a Wonderful World Le Monde est merveilleux | W.S. Van Dyke |
| 1939 | Made for Each Other Le Lien sacré | John Cromwell |
| 1939 | Mr. Smith Goes to Washington Mr. Smith au sénat | Frank Capra |
| 1939 | Shop Around the Corner (The) Rendez-vous | Ernst Lubitsch |
| 1940 | Come Live with Me Viens avec moi | Clarence Brown |
| 1940 | Mortal Storm | Frank Borzage |
| 1940 | No Time for Comedy [Finie la comédie] | William Keighley |
| 1940 | Philadelphia Story (The) Indiscrétions | George Cukor |
| 1941 | Pot O'Gold L'Or du ciel | George Marshall |
| 1941 | Ziegfeld Girl La Danseuse des Folies Ziegfeld | Robert Z. Leonard |
| 1946 | It's a Wonderful Life La Vie est belle | Frank Capra |
| 1947 | Call Northside 777 Appelez Nord 777 | Henry Hathaway |
| 1947 | Magic Town | William A. Wellman |
| 1947 | On Our Merry Way La Folle enquête | King Vidor, Leslie Fenton |
| 1948 | Rope (The) La Corde | Alfred Hitchcock |
| 1948 | Stratton Story (The) | Sam Wood |
| 1948 | You Gotta Stay Happy | Henry C. Potter |
| 1949 | Broken Arrow La Flèche brisée | Delmer Daves |
| 1949 | Malaya | Richard Thorpe |
| 1950 | Harvey | Henry Koster |
| 1950 | Jackpot (The) Gare au percepteur | Walter Lang |
| 1950 | No Highway = No Highway in the Sky Le Voyage fantastique | Henry Koster |
| 1950 | Winchester 73 | Anthony Mann |
| 1951 | Bend of the River Les Affameurs | Anthony Mann |
| 1951 | Greatest Show on Earth (The) Sous le plus grand chapiteau du monde | Cecil B. DeMille |
| 1952 | Carbine Williams L'Homme à la carabine | Richard Thorpe |
| 1952 | Naked Spur (The) L'Appât | Anthony Mann |
| 1952 | Thunder Bay Le Port des passions | Anthony Mann |
| 1953 | Far Country (The) Je suis un aventurier | Anthony Mann |
| 1953 | Glenn Miller Story (The) Romance inachevée | Anthony Mann |
| 1953 | Rear Window Fenêtre sur cour | Alfred Hitchcock |
| 1954 | Man from Laramie (The) L'Homme de la plaine | Anthony Mann |
| 1954 | Strategic Air Command | Anthony Mann |
| 1955 | Man Who Knew too Much (The) L'Homme qui en savait trop | Alfred Hitchcock |
| 1955 | Spirit of St. Louis (The) L'Odyssée de Charles Lindbergh | Billy Wilder |
| 1957 | Night Passage Le Survivant des monts lointains | James Neilson |
| 1957 | Vertigo Sueurs froides | Alfred Hitchcock |
| 1958 | Bell, Book and Candle L'Adorable voisine | Richard Quine |
| 1959 | Anatomy of a Murder Autopsie d'un meurtre | Otto Preminger |
| 1959 | FBI Story (The) La Police fédérale enquête | Mervyn LeRoy |
| 1959 | Mountain Road (The) Commando de destruction | Daniel Mann |
| 1960 | Two Rode Together Les Deux cavaliers | John Ford |
| 1961 | How the West Was Won La Conquête de l'Ouest | John Ford, George Marshall, Henry Hathaway |
| 1961 | Man Who Shot Liberty Valance (The) L'Homme qui tua Liberty Valance | John Ford |
| 1961 | Mr Hobbs Takes a Vacation Mr Hobbs prend des vacances | Henry Koster |
| 1961 | X 15 | Richard Donner |
| 1963 | Cheyenne Autumn Les Cheyennes | John Ford |
| 1963 | Take Her She's Mine Ah, si papa savait ça | Henry Koster |
| 1964 | Dear Brigitte Chère Brigitte | Henry Koster |
| 1964 | Shenandoah Les Prairies de l'honneur | Andrew V. McLaglen |
| 1965 | Flight of the Phoenix (The) Le Vol du phoenix | Robert Aldrich |
| 1965 | Rare Breed (The) Rancho Bravo | Andrew V. McLaglen |
| 1967 | Bandolero ! | Andrew V. McLaglen |
| 1967 | Firecreek Les Cinq hors-la-loi | Vincent McEveety |
| 1969 | Cheyenne Social Club (The) L'Attaque au Cheyenne club | Gene Kelly |
| 1970 | Fool's Parade [Le Rendez-vous des dupes] | Andrew V. McLaglen |
| 1971 | Directed by John Ford | Peter Bogdanovich |
| 1974 | That's Entertainment ! Il était une fois à Hollywood | Jack Haley Jr. |
| 1976 | Shootist (The) Le Dernier des géants | Don Siegel |
| 1977 | Airport 77 Les Naufragés du 747 | Jerry Jameson |
| 1977 | Once Upon a Time Is Now : The Story of Princess Grace | Kevin Billington |
| 1978 | Big Sleep (The) Le Grand sommeil | Michael Winner |
| 1978 | Magic of Lassie (The) La Magie de Lassie | Don Chaffey |
| 1981 | Afurika monogatari | Susumu Hani, Simon Trevor |
| 1991 | An American Tail : Fievel Goes West Fievel au Far West | Phil Nibbelink, Simon Wells |
| 1994 | A Century of Cinema | Caroline Thomas |