Fils d'un professeur de lycée, Pierre Fresnay monte sur les planches pour la première fois à l'âge de quatorze ans. Grâce à son oncle Garry, comédien, il joue un petit rôle dans L'aigrette, au Théâtre Réjane. En 1914, il entre au Conservatoire et figure dans la classe de Paul Mounet et de Georges Berr. Un an plus tard, il est engagé à la Comédie-Française. Dès 1915, il décroche un premier grand rôle au théâtre dans Les jeux de l'amour et du hasard. La même année, il débute au cinéma avec France d'abord d'Henri Pouctal.
Après avoir joué dans quelques films muets, Pierre Fresnay s'impose à l'écran avec Marius (1931) d'Alexandre Korda, d'après la pièce de Marcel Pagnol. Pour ce rôle traditionnellement réservé aux natifs du Midi, l'acteur profite de quelques jours de liberté pour se rendre à Marseille et s'imprégner de l'accent du pays. Le succès du film fait de Pierre Fresnay une vedette. Plus tard, il apparaît dans deux autres titres de Pagnol, Fanny (1932) et César (1936).
En 1934, il joue Armand Duval au côté d'Yvonne Printemps dans La dame aux camélias de Fernand Rivers. La même année, Alfred Hitchcock lui confie un rôle court mais essentiel, celui du Français qu'on assassine dans L'homme qui en savait trop. Georg Wilhelm Pabst (Mademoiselle Docteur, 1936) et Abel Gance (Le roman d'un jeune homme pauvre, 1935) l'emploient également. Doué d'une grande aisance de jeu, Pierre Fresnay incarne aussi bien l'anarchiste de Sous les yeux de l'Occident (1936) de Marc Allégret que le journaliste primesautier de La bataille silencieuse (1937) de Pierre Billon, ou encore le bagnard de Chéri-Bibi (id.) de Léon Mathot. Mais son rôle légendaire reste celui de l'aristocrate fier et nostalgique, De Boëldieu de La grande Illusion (id.) de Jean Renoir face à Jean Gabin et Erich von Stroheim. Avec Trois valses (1938) de Ludwig Berger, auprès d'Yvonne Printemps, Fresnay devient plus populaire que jamais. Puis la rencontre avec Henri-Georges Clouzot, scénariste obscur à l'époque, lui inspire un style encore différent, non moins remarquable. Détective ironique du Dernier des six (1941) de Georges Lacombe ou de L'assassin habite au 21 (1942) d'Henri-Georges Clouzot, il est aussi le peintre halluciné de La main du Diable (id.) de Maurice Tourneur ou l'âpre docteur Germain du Corbeau (1943) d'Henri-Georges Clouzot. Après la Seconde Guerre mondiale, Pierre Fresnay se distingue par des compositions intactes de perfectionnisme, qui redonnent vie à de grandes figures historiques. Il incarne tour à tour saint Vincent de Paul (Monsieur Vincent, 1947, de Maurice Cloche), l'entomologiste Fabre (Monsieur Fabre, 1951, d'Henri Diamant-Berger), Jacques Offenbach (la Valse de Paris, 1949, de Marcel Achard) ou un aéronaute (Au grand balcon, id., d'Henri Decoin). En 1960, il fait ses adieux au grand écran avec Les vieux de la vieille, une comédie de Gilles Grangier, pour se consacrer au théâtre et à la télévision.
Sociétaire de la Comédie-Française qu'il quitte en 1927, Pierre Fresnay est un célèbre comédien et s'illustre sur les planches notamment dans Un miracle, La chienne aux yeux de femme, Cyrano de Bergerac, Marius, Bloomfield, Cette vieille canaille, Jean III, L'hermine, L'idée fixe, Visitation.
A la télévision, il interprète Tête d'horloge (1969) de Jean-Paul Sassy.
En 1939, Fresnay réalise Le duel avec Yvonne Printemps.
En 1954, il publie ses Mémoires, Je suis comédien.
Courts métrages 1923 | Petit Jacques (Le) | Georges Lannes, Georges Raulet |
| 1930 | Ca aussi c'est Paris | Antoine Mourre |
| 1949 | Gisants (Les) | Jean-François Noël |
Longs métrages| 1939 | Duel (Le) | Pierre Fresnay |
| 1915 | France d'abord | Henri Pouctal |
| 1915 | Quand même | Henri Pouctal |
| 1920 | Essor (L') | Charles Burguet |
| 1922 | Baillonnée (La) | Charles Burguet |
| 1922 | Diamant noir (Le) | André Hugon |
| 1922 | Molière, sa vie, son oeuvre | Jacques de Féraudy |
| 1922 | Mystères de Paris (Les) | Charles Burguet |
| 1923 | Mendiante de Saint-Sulplice (La) | Charles Burguet |
| 1924 | Premières armes de Rocambole (Les) | Charles Maudru |
| 1928 | Vierge folle (La) | Luitz-Morat |
| 1931 | Marius | Alexander Korda |
| 1932 | Fanny | Marc Allégret |
| 1933 | Âme de clown | Marc Didier, Yvan Noé |
| 1934 | Dame aux camélias (La) | Abel Gance, Fernand Rivers |
| 1934 | Man Who Knew too Much (The) L'Homme qui en savait trop | Alfred Hitchcock |
| 1935 | Koenigsmark | Maurice Tourneur |
| 1935 | Roman d'un jeune homme pauvre (Le) | Abel Gance |
| 1935 | Sous les yeux d'Occident = Razoumov | Marc Allégret |
| 1936 | César | Marcel Pagnol |
| 1936 | Mademoiselle Docteur = Salonique, nid d'espions | Georg Wilhelm Pabst |
| 1937 | Bataille silencieuse (La) | Pierre Billon |
| 1937 | Chéri-Bibi | Léon Mathot |
| 1937 | Grande illusion (La) | Jean Renoir |
| 1937 | Puritain (Le) | Jeff Musso |
| 1938 | Adrienne Lecouvreur | Marcel L'Herbier |
| 1938 | Alerte en Méditerranée | Léo Joannon |
| 1938 | Trois valses | Ludwig Berger |
| 1939 | Charrette fantôme (La) | Julien Duvivier |
| 1939 | Duel (Le) | Pierre Fresnay |
| 1941 | Briseur de chaînes (Le) | Jacques Daniel-Norman |
| 1941 | Dernier des six (Le) | Georges Lacombe |
| 1941 | Inconnus dans la maison (Les) | Henri Decoin |
| 1942 | Assassin habite au 21 (L') | Henri-Georges Clouzot |
| 1942 | Journal tombe à cinq heures (Le) | Georges Lacombe |
| 1942 | Main du diable (La) | Maurice Tourneur |
| 1943 | Corbeau (Le) | Henri-Georges Clouzot |
| 1943 | Escalier sans fin (L') | Georges Lacombe |
| 1943 | Je suis avec toi | Henri Decoin |
| 1943 | Voyageur sans bagage (Le) | Jean Anouilh |
| 1945 | Fille du diable | Henri Decoin |
| 1946 | Visiteur (Le) | Jean Dréville |
| 1947 | Condamnés (Les) | Georges Lacombe |
| 1947 | Monsieur Vincent | Maurice Cloche |
| 1948 | Barry | Richard Pottier |
| 1949 | Au grand balcon | Henri Decoin |
| 1949 | Ce siècle a cinquante ans | Denise Tual |
| 1949 | Valse de Paris (La) | Marcel Achard |
| 1949 | Vient de paraître | Jacques Houssin |
| 1950 | Dieu a besoin des hommes | Jean Delannoy |
| 1950 | Justice est faite | André Cayatte |
| 1951 | Monsieur Fabre | Henri Diamant-Berger |
| 1951 | Un grand patron | Yves Ciampi |
| 1951 | Voyage en Amérique (Le) | Henri Lavorel |
| 1952 | Il est minuit, Docteur Schweitzer | André Haguet |
| 1953 | Défroqué (Le) | Léo Joannon |
| 1953 | Route Napoléon (La) | Jean Delannoy |
| 1954 | Evadés (Les) | Jean-Paul Le Chanois |
| 1955 | Aristocrates (Les) | Denys de La Patellière |
| 1956 | Homme aux clefs d'or (L') | Léo Joannon |
| 1957 | Fanatiques (Les) | Alex Joffé |
| 1957 | Oeufs de l'autruche (Les) | Denys de La Patellière |
| 1958 | Et ta soeur | Maurice Delbez |
| 1958 | Tant d'amour perdu | Léo Joannon |
| 1959 | Affreux (Les) | Marc Allégret |
| 1959 | Grand secret (Le) | Gérald Calderon |
| 1959 | Millième fenêtre (La) | Robert Ménégoz |
| 1960 | Vieux de la vieille (Les) | Gilles Grangier |
| 1969 | Dieu a choisi Paris | Gilbert Prouteau |